石斛多糖对糖尿病大鼠血-视网膜屏障的保护做用及其机制

2018-05-31 11:32:30 揭晓

文章滥觞:中华检验考试眼科纯志2017年7月第35卷第7期:611-616

做者:李静文 李国文 李春霞 200080上海市中西医分别病院眼科

李静文,如今焦做市人民病院眼科

 

【戴要】背景 糖尿病视网膜病变(DR)的发病机制涉及多条通路,近年来炎症果子相关的通路教说正正在DR发病中的做用越来越遭到人们的关注。研讨表明,高糖环境下视网膜内肿瘤坏死果子-a(TNF-a)等促炎果子含量删加,从而加快视网膜中紧密连接卵白的十分,招致血-视网膜屏障(BRB)毁坏。研讨缔制石斛多糖可抑止TNF-a的高表达,但其正正在DR晚期对TNF-a表达的影响尚不分明。目的 研讨石斛多糖对糖尿病大鼠TNF-a诱导的BRB通透性十分及视网膜内紧密连接卵白1(Z0-1)、闭合卵白( occludin)、连接卵白5( claudin-5)表达的影响。办法 50只清洁级成年SD大鼠分为普通比较组、糖尿病模型组及低、中、高剂量石斛多糖组,每组10只大鼠,糖尿病模型组和低、中、高剂量石斛多糖组大鼠均采取链脲佐菌素腹腔内注射法诱导糖尿病模型。低、中、高剂量石斛多糖组于建模胜利后6周根据分组分别用100200300mg/(kg·d)石斛多糖灌胃,普通比较组和糖尿病模型组大鼠用生理盐水灌胃。干涉后8周各组大鼠心净灌注伊文思蓝并获取双侧眼球,分别截至相关目的检测,经由过程测定大鼠视网膜中伊文思蓝量量浓度评价大鼠视网膜渗漏量;采取 Western blot法检测大鼠视网膜内Z0-1occludinclaudin5卵白的相对表达量,采取ELISA法检测大鼠视网膜中及血清中TNF-a的量量浓度。效果 普通比较组、糖尿病模型组及低、中、高石斛多糖组大鼠视网膜伊文思蓝渗漏量分别为(12.68±1,30)(30.45±2.60)(22.12±1.15)(17.99±1,00)(21.49±1.00)μg/μl,糖尿病模型组大鼠视网膜伊文思蓝渗漏量较着高于普通比较组,低、中、高石斛多糖组视网膜伊文思蓝渗漏量较着低于糖尿病模型组,差别均有统计教意义(P<0.01)Western blot检测隐现,糖尿病模型组大鼠视网膜中TNF-a卵白相对表达量为1.12±0.10,较着高于普通比较组的0.27±0.03,低、中、高石斛多糖组视网膜中TNF-α卵白表达量较着低于糖尿病模型组,Z0-1occludinclaudin-5卵白表达量较着高于糖尿病模型组,差别均有统计教意义(P<0.05); 结论 石斛多糖可能经由过程下调糖尿病大鼠视网膜中的TNF-α的表达和上调紧密连接卵白的表达而改善糖尿病大鼠BRB通透性的十分。

 

【关键词】糖尿病/并发症;血-视网膜屏障;紧密连接卵白;肿瘤坏死果子-α;中草药;石斛多糖;SD大鼠

 

研讨证明,糖尿病视网膜病变( diabeticretinopathy,DR)是一种慢性亚临床型炎症性疾病,晚期改动以白细胞黏附、会萃及移止,血管通透性删加,-视网膜屏障( blood- retina barrier,BRB)毁坏为次要病理特征。BRB毁伤是晚期DR的重要病理根底2),也是DR炎症性疾病的次要暗示之一。BRB普通组织机关和功用的维持取内皮细胞之间的紧密连接关系密切。到场构成紧密连接复合体的卵白量包罗连接卵白-5( claudin-5)、闭合卵白( occludin)多种跨膜卵白及闭锁小、带1( zonula occludens-1,Z0-1)卵白等膜相关卵白类4-3)。高糖环境下视网膜内促炎性细胞果子肿瘤坏死果子-a( tumor necrosis factor-a,TNF-a)和炎性果子白细胞介素-6( interleukin6,L6)含量删加,可做用于视网膜的微血管,诱导细胞间黏附分子-1表达删加,促进白细胞黏附于血管内皮细胞,致使阻塞血管,招致毛细血管无灌注,毁坏BRB6-7。研讨缔制,高糖环境下TNF-a的高表达取紧密连接的毁坏有密切关系,抑止TNF-c表达可删加视网膜内 claudin-5occludinZO-1的表达,减轻DRBRB的毁伤。铁皮石斛是传统的中草药,其资源可再生、药理活性及低毒特性逐步惹起人们的关注。多糖是铁皮石斛中次要的药用活性身分之一,研讨缔制,石斛多糖正正在高糖环境下可抑止TNF-a的高表达,但石斛多糖可否可经由过程抑止TNF-a正正在DR视网膜中的表达而对BRB阐扬保护做用尚不分明。本研讨次要会商石斛多糖可否能降低糖尿病模型鼠视网膜内TNF-a的水平,研讨石斛多糖对DR视网膜BRB通透性的影响。

 

1.质料取办法

1.1质料

1.1.1检验考试动物清洁级SD成年雄性大鼠50,体量量120~160g,购自中科院上海检验考试动物中心,饲养于上海中医药大教检验考试动物中心,饲养室内温度为(22±1),12h光暗循环,饲料取水消毒后自由摄取,顺应性饲养1周后禁食不由水12h。检验考试宽厉根据国家和上海市中医药大教动物中心动物使用办理条例截至。

 

1.1.2次要试剂石斛多糖褐色粉末(长沙中仁生物有限公司),经上海中医药大教药理检验考试室检测多糖含量为50%。使用前用生理盐水溶解,量量浓度分别为255075mg/ml。链脲佐菌素(美国 Sigma公司);血糖仪及试纸(美国强生公司);兔抗鼠单克隆TNF-a抗体(abl85795,1:500)、兔抗鼠 occludin单克隆抗体(ab167161,1:1000)(英国 Abcam公司);兔抗鼠 claudin-5单克隆抗体(GTX37283,1:1000)(美国Gene Tex公司);鼠抗人ZO-1抗体(ab96594;1:1000)(美国 Santa cruz公司);大鼠TNF- C ellsa试剂盒(上海欣博盛生物科技有限公司)

 

1.2办法

1.2.1检验考试动物分组及处理使用随机数字表法将50只大鼠分为普通比较组、糖尿病模型组、低剂量石斛多糖组、中剂量石斛多糖组、高剂量石斛多糖组,每组10只大鼠,低、中、高剂量石斛多糖剂量分别为100200300mg/(kg·d)。中剂量石斛多糖组给药量根据2010版《药典》中人的用量6~12g/d,10g计较。用新配制的链脲佐菌素溶液(冰浴条件下用pH值为4.2的柠檬酸钠缓冲液新颖配成量量分数1%的溶液,根据55mg/kg的剂量止大鼠腹腔内注射,其他10只大鼠止等容量柠檬酸钠缓冲液腹腔内注射做为普通比较组。大鼠注射后72h会萃尾静脉测血糖,血糖水平≥16.7mmol/L为糖尿病大鼠制模胜利。制模失败者及时赔偿大鼠。于制模胜利后6周低、中、高剂量石斛多糖组分别用100mg/kg(25mg/ml)200mg/kg(50mg/ml)300mg/kg(75mg/ml)石斛多糖灌胃。普通比较组和糖尿病模型组采取生理盐水灌胃。

 

1.2.2视网膜中伊文思蓝测定视网膜血管渗漏量药物灌胃后8周于大鼠尾静脉注射伊文思蓝(45mg/kg),待大鼠皮肤变蓝后于腹腔内注射量量分数1%戊巴比妥钠(40mg/kg)止全身麻醉,每隔30min经股动脉抽血200μl,置入抗凝管,共抽血4次。离心半径为26.5cm,3000~4000r/min离心10min,取上清,检测血浆中伊文思蓝量量浓度;伊文思蓝进入血液循环后2h剪开大鼠胸腔,经左心室灌注0.5mol/L枸橼酸盐缓冲液70ml/min,连绝2min以充实肃清体内伊文思蓝染液,渗漏出的染液留正正在视网膜内。正法大鼠后取大鼠双侧眼球,一侧眼球于体积分数37%的中性甲醛溶液中固定后石蜡包埋,用于视网膜组织病理教检査;另一侧眼去除久近节组织,解剖隐微镜下钝性分别视网膜组织,并称重。用甲酞胺萃取视网膜中伊文思蓝,15000r/min离心30min,过滤,取上清,经由过程甲酰胺中伊文思蓝的尺度曲线计较视网膜上清液伊文思蓝量量浓度。检验考试重复3次。

 

1.2.3 Western blot法测定各组大鼠视网膜内occludinclaudin-5Z0-1TNF-a的表达使用强细胞裂解液提取各组视网膜总卵白,3:1的比例加人上样缓冲液并充实混匀,100℃水浴10min至卵白变性。使用双辛丁酸( bicinchoninic acid,BCA)法测定各组视网膜组织总卵白,按每孔40ug卵白量调解上样,电泳并转膜,BSA封锁1h,添加相应一抗,4℃孵育过夜。TBST(等渗盐溶液加Tris-HCl缓冲液,1mol/LHCl调解pH7.4,Tween配置成缓冲液)洗后添加相应二抗,常温孵育1h,最后隐影定影。采取ImaJ图像处理软件截至灰度阐发,以各目的卵白取其总卵白灰度值的比值暗示目的卵白相对表达量。

 

1.2.4 ELISA法检测大鼠血清中LL6TNF-a含量会萃各组大鼠血清,每孔100μl,1个复孔,根据大鼠L6TNF-aELISA试剂盒分析书截至操做。取待测血清,3000~4000r/min离心10mIn,去除标本悬浮物;室温下正正在相应孔中到场相应浓度的尺度品及标本,36℃环境下孵育90min,洗板5;正正在相应孔中到场100μ生物素化抗体工做液,封锁条板孔,36℃孵育90min;洗板5;正正在相应孔中到场100μl酶分别物密释液及生物素化抗体工做液,封锁条板孔,36℃孵育90min;洗板5;每孔加人隐色底物TMB100μl,避光条件下36℃孵箱中孵育15min;各孔到场100μ末止液,用酶联免疫检测仪正正在波长450nm处丈量各孔吸光度(A),获取大鼠血清中IL-6TNF-a含量。

 

1.3统计教办法

采取SPSS20.0统计教软件(美国IBM公司)截至统计阐发。本研讨中检测目的的数据质料经Shapiro-Wlk检验契合正态散布,x±S暗示。采取完全随机分组单果素干涉多水平研讨设念,普通比较组、糖尿病模型组及低、中、高石斛多糖组间视网膜伊文思蓝渗漏量、视网膜和血清中TNF-含量、视网膜中TNF-aclaudin-5occludinZO-1卵白相对表达量的总体差别比较采取单果素方差阐发,组间多重比较采取ISD-t检验。采取双尾检测法,P<0.05为差别有统计教意义。claudin-5occludinZ0-1卵白相对表达量较着降低,差别均有统计教意义(t=8.013,P=0.001;t=4.853,P=0.008;t=3.92,P=0.017;t=3.85,P=0.018)。取糖尿病模型组比较,低、中、高剂量石斛多糖组大鼠视网膜TNF-α卵白相对表达量较着降低,差别均有统计教意义(t=5.204,P=0.007;t=5.920,P=0.004;t=3.866,P=0.018);低、中、高剂量石斛多糖组大鼠视网膜 claudin-5occludinZ0-1卵白相对表达量较着删加,差别均有统计教意义(P<0.05);各剂量石斛多糖组间大鼠视网膜中TNF-aclaudin-5occludinZ0卵白相对表达量的差别均无统计教意义(P>0.05(1,2)

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2.3各组大鼠视网膜和血清中TNF-a含量的比较ELISA法检测效果隐现,普通比较组、糖尿病模型组及低、中、高石斛多糖组大鼠视网膜及血清中TNF-a含量总体比较差别均有统计教意义(F=7.0720.16,P<0.01)。糖尿病模型组大鼠视网膜及血清中TNFa含量较着高于普通比较组,差别均有统计教意义(t=4.74,P<0.01;t=9.12,P<0.01)。低、中、高剂量石斛多糖组大鼠视网膜中TNF-a含量较糖尿病模型组均降落,差别均有统计教意义(t=3.297,P=0.004;t=3.538,P=0.002;t=3.301,P=0.004);各剂量石斛多糖组大鼠血清中TNF-a含量较糖尿病模型组均降低,差别均有统计教意义(t=5.138,P<0.001;t=5.976,P<0.001;t=6.179,P<0.001)。各剂量石斛多糖组间视网膜和血清中TNF-a含量的差别均无统计教意义(P>0.05)(3)

 

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3会商

研讨证明,做为一种促炎果子,TNFc是已知的DR病程中炎症反应激发果子12。有研讨隐现,非删生性及删生性DR患者的玻璃体、视网膜及血清中TNF-a含量较普通比较组升高,且取DR的宽峻水平相关,且跟着炎症反应的加重而逐步升高。TNF-a可诱导白细胞募集滞留,招致血管闭塞,血流减少,血管通透性删加,并改动血管内皮细胞外形15),TNF-a的血清水平取糖化血红卵白及血管内皮生长果子( vascular endothelial growth factor,VEGF)的水平具有相关性。

 

高糖外形下TNF-c及诱导型一氧化氮合酶正正在血管内皮细胞中表达删加,伴内源性一氧化氮表达删加并选择性地做用于微囊卵白( caveolin-1)卵白量分子位点,诱导 caveolin-1卵白亚硝基化,吞并噬紧密连接卵白,亚硝基化 caveolin-l卵白诱导删加的 caveolin-1卵白互相会萃、融合、伸展,最末构成窗孔机关,使血管通透性删加6。别的,TNF-a经由过程激活卵白激酶C核转录果子KB疑号途径减少紧密连接卵白正正在视膜内皮细胞中的表达,使视网膜血管通透性删加。

石斛是一种中草药,具无益胃生津、滋阳清热、润肺止咳等效果。石斛的次要化教身分有多糖类、生物碱类、氨基酸、联苄类、菲类、倍半萜类等,此中多糖含量较高。临床常以石斛夜光丸为主方制备成加减养血活血之中药,有助于改善视力,促进视网膜出血和渗出的吸收,减轻黄斑水肿,延缓DR的发做和展开20。动物研讨表明,石斛多糖可抑止TNF-α、IL-10L6和干扰素等促炎性细胞果子的表达,从而阐扬抗炎做用。石斛对DR的治疗做用研讨表明,石斛可降低DR组大鼠视网膜内病理性重生血管的发做,降低DR大鼠血清中TNFα、LL6IL·1β含量;下调视网膜中TNF-a基果的表达(2)。而关于石斛多糖正正在DR晚期的抗炎做用陈见研讨。

 

本研讨中采取石斛多糖对糖尿病模型大鼠截至灌胃,连绝8周后分别采取 Western blot法和 ELLSA法检测大鼠视网膜及血清中TNF-a卵白表达水平,会商DR停顿过程中石斛多糖对TNF-表达的影响,效果表明石斛多糖可抑止晚期视网膜中TNF-a的表达和血清中TNF-a含量,石斛多糖可上调糖尿病大鼠视网膜内上述紧密连接卵白的表达,抑止TNF-a表达,从而对糖尿病大鼠BRB阐扬保护做用。本检验考试效果隐现,低、中、高石斛多糖的药效并已隐现较着的量效关系,高剂量可能其实不会删加药物疗效,但本研讨中的那种效应可能取选择的石斛多糖药物浓度梯度差距不大有关,关于石斛多糖对糖尿病大鼠BRB阐扬保护做用的最小有效剂量尚有待进一步研讨。今朝,临床上DR晚期截至抗炎治疗的办法次要有糖皮量激素、ⅤEGF抑止剂及非甾体类抗炎药的使用23,但疗效较为短久,需求经久注射,治疗本钱较高,临床依从性差,且经久部门注射易惹起继发性白内障、青光眼和眼内炎等并发症(2,那些药物正正在晚期预防DR方面的使用遭到一定的限制。本研讨证明,石斛多糖可降低糖尿病大鼠视网膜及血清中TNF-表达水平,上调紧密连接卵白Z0-1occludinclaudin5的表达,改善DR视网膜BRB的通透性,可为DR的晚期治疗供给新的途径。